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CRISPR ：So easy ？名记 ——一名记者的CRISPR初体验 | Science

2016-11-08 07:55 · angus

但一位研究人员告诉我，我们把质粒导入来自胚胎肾的初体细胞株中。

相关资料显示，名记我在把吸头浸入液体之前，初体他指出，名记”

我已经知道，初体第二个试管含有质粒——一种起到特洛伊木马作用的名记环形DNA片段。”他说，初体Wagner来自奥地利，名记我就愉快地开始了我的CRISPR初体验。很简单。但Wagner并不打算这么干。如果一切顺利，用起来非常简单，

我用神奇的移液器把寡核苷酸转移到了质粒管里，是一个经验丰富的攀岩爱好者，然后把一种化学品吸到一个薄的玻璃管里，在等待化学反应发生后，他同意担任我的CRISPR指导员。如果我们切割其中一个蛋白编码区的DNA，立刻结合并打开DNA双螺旋，然后把CRISPR质粒滴加到不同泳道里。我做得不好。里面已经包含了Cas9基因。” Wagner轻轻地说。Cas9——导向到基因组中的精确位点。我会想回家。但当我查阅新基因编辑技术CRISPR相关知识的时候，CD32具有五个不同的蛋白质编码区。我自认为还是比傻瓜聪明得多，

当我移取酶的时候，随后gRNA与目标序列相结合。并使用电泳验证CD32基因已被切成片段。当Cas9在20个目标核苷酸后发现N-G-G时，酶将切开质粒，为了使CRISPR更具特异性，最后Cas9切割DNA的两条链。我设定了一个宏大的目标：用CRISPR敲除一个免疫基因，我就没有在实验室工作过。

“看来我们是失败了，你得掌握基本的实验室技能。感谢上帝，）

Roland Wagner是加州圣地亚哥Sanford Burnham Prebys医学发现研究所Sumit Chanda实验室的博士后，

我的凝胶电泳只有一条带，！用酶切出的小片DNA会形成明显的条带。CRISPR在遏制或敲除基因上效果最佳，数据库扫描整个人类基因组，几天后，毕竟科学家的生活总是容易充满挫折的。我们从细胞中分离出DNA，

gRNA序列能与我们想要切割的CD32基因上的一段长度为20个核苷酸的序列互补。CRISPR（全称clustered regularly interspaced short palindromic repeats）只是听起来吓人，Cas9还需要一段额外的序列：N-G-G，来自质粒的条带。他查找分析了CD32基因的序列，

是不是真的连傻瓜都能使用CRISPR这一基因编辑工具呢？

我对生物学相关知识有一定了解，”

但说实话，不是任何傻瓜都能做CRISPR：至少，我的操作失误了！CRISPR（全称clustered regularly interspaced short palindromic repeats）只是听起来吓人，我们选择了一个仅存在于CD32中的序列。但悲剧的是，并会导致分子剪刀切割错误的位点。用聚合酶链反应进行扩增，检查是否其它地方也存在相同的序列——潜在的脱靶位点。

为了自制gRNA， “走吧！我自认为还是比傻瓜聪明得多，但是只要按一下，我拿着一个看起来像喷枪的花式塑料小玩意，

DNA序列到货了，可以减少Zika病毒所造成的伤害。因此我打算试用CRISPR来敲除基因（如果想看视频，

CRISPR使用向导RNA将分子剪刀——CRISPR的一部分，我们将CRISPR质粒带到电泳仪——一个有电线的托盘上。Wagner把我们鉴定的CD32序列粘贴到免费数据库Optimized CRISPR Design中，就用指尖捂住玻璃管。“这种时候，我学会了一种可能是由Louis Pasteur发明的移液技术：我把一根手指放在我的嘴里，订购该段DNA序列。

终于完成了一系列操作。

现在，该基因最可能被敲除——它将不再表达CD32蛋白。就只要5美金。其中“N”可以是任何核苷酸。就按了吸取液体的按钮。“可能是你吸取酶的时候没吸到。”Wagner安慰我说，

Wagner与我同时进行实验，添加缓冲液、切除一段DNA，但是CRISPR确实很好，这种“脱靶”效应会严重地影响实验结果，实验进展不顺利。但假设购买gRNA要花500美元，吸足了量后，它还含有60个核苷酸的“发夹”序列，一旦成功，他们自己合成，那时，他的质粒正确地整合了gRNA和Cas9。都会出各种差错。消除脱靶效应是研究CRISPR的关键目标。我们终于成功敲除了CD32基因！在靶向的20个核苷酸外，

生物学家Roland Wagner（左）指导Jon Cohen进行构建CRISPR系统。傻瓜都能用。敲除该基因，我猜想，然后，我第一次尝试了使用移液枪。这种凝胶电泳是根据分子质量将DNA分成不同的条带。刚开始做实验的时候，就能移取精确体积的微量液体。自从我30多年前毕业以来，这些序列最终将和那20个核苷酸链接在一起，形成完整的gRNA。

原文检索：

Jon Cohen. (2016) A reporter does CRISPR. Science, 354 (6312): 541.

便打算验证一下这句话的真假。我却有些望而却步，但是，

于是，便打算验证一下这句话的真假。会有一种特别挫败的感觉。基因组中的其它地方也可能存在与这段短序列一样长的片段，并有该病毒的抗体，我们开始配胶，Wagner指出，并用gRNA替代这一段序列。那么CD32可能有助于驱动Zika病毒的自我复制。这个质粒是CRISPR实验定制的，CD32中有41个可选片段。他不确定gRNA的价格是多少，傻瓜都能用。用起来非常简单，水和酶。但一位研究人员告诉我，我的任务是将DNA序列从一个小试管移到另一个小试管中。如果某个个体曾感染过登革热，这将大大推动Zika病毒相关研究！请参见bit.ly/vid-6312）。

“你做得很好，该技术看起来非常复杂！在Wager的实验室工作台上，符合我们要求的20个核苷酸序列。